NANOBIOMECÁNICA: la evolución del movimiento a nivel molecular

Leyre Baradiaran (1) y Raúl Pérez Jiménez (2)

(1) Investigadora predoctoral en el grupo de Nanobiomecánica del CIC nanoGUNE.(2) Ikerbasque Research Profesor y jefe del grupo de Nanobiomecánica del CIC nanoGUNE.

Los animales han desarrollado complejos sistemas de locomoción basados en el movimiento de los músculos. La unidad básica contráctil en los músculos es el sarcómero que se encuentra en todos los vertebrados. Paradójicamente, la fisiología muscular de los vertebrados es extremadamente diversa, sin que se tenga una explicación para ello. En un reciente trabajo, hemos investigado la evolución de las proteínas que componen el sarcómero para estudiar cómo estas han influenciado la evolución de nuestros músculos y su movimiento. Utilizando técnicas computacionales, hemos sido capaces de resucitar fragmentos de la proteína muscular titina de entre 105 y 356 millones de años de edad, los cuales hemos estudiado con técnicas de espectroscopia de fuerzas. Estos estudios nos han permitido identificar los elementos mecanoquímicos de la titina, que han sido directamente responsables de su evolución y la de los músculos, y que nos permiten incluso estimar el tamaño de especies extintas.

Los animales nos distinguimos de las plantas gracias a una característica: el movimiento. El hecho de moverse es la base de nuestro desarrollo fisiológico e incluso social. La habilidad motora ha servido como elemento de culto en todas las civilizaciones; los griegos con las danzas dionisiacas, las olimpiadas que todavía perduran o las danzas que los mayas dedicaban a los dioses entre otros. El movimiento es la base de nuestra existencia y la del resto de animales. La habilidad para movernos y la basta variedad de movimientos se la debemos a los músculos. El músculo es un tejido que se encuentra en la mayoría de animales.

Los músculos generan movimiento al contraerse o extendiéndose al relajarse. Hay dos tipos de tejido muscular: El tejido muscular liso, que forma parte de las paredes de las vísceras y no está bajo el control de la voluntad; y el tejido muscular estriado, que se fija en los huesos (a través de los tendones) o la piel siendo el encargado del movimiento de los esqueletos y del mantenimiento de la postura corporal. Además, el tejido esquelético ocular ejecuta los precisos movimientos de los ojos. El tejido estriado contiene como unidad anatómica y funcional el sarcómero, que se considera la unidad delimitada entre los llamados discos Z pasando por la llamada línea M (Figura 1). En su composición destacan las proteínas actina, miosina y titina. Esta última conecta el disco Z a la línea M, ambos componentes que forman la estructura del sarcómero.

Las unidades estructurales de las proteínas son los aminoácidos. En la naturaleza existen 20 aminoácidos diferentes con los que se ensamblan todas las proteínas que existen. La titina es la proteína más grande que se conoce, contiene aproximadamente 30000 aminoácidos mientras que la actina y miosina contienen unos 500. En la titina los aminoácidos se ordenan en diferentes estructuras: dominios inmunoglobulina, fibronectinas y partes no estructuradas denominadas PEVK. La principal función de la titina es aportar elasticidad pasiva al músculo actuando como un muelle. En la evolución de los vertebrados la estructura muscular basada en sarcómeros se ha conservado, a pesar de que la fisiología de los músculos entre los vertebrados sea extremadamente variada. Así, los animales presentan diferentes fisiologías musculares que guardan estrecha relación con su fisionomía y su hábitat. En este contexto, el estudio evolutivo de las especies cobra un papel principal. Según la teoría de la evolución de Darwin, las especies evolucionan a partir de sus ancestros adaptándose a nuevas condiciones, lo que implica cambios fisiológicos que pueden afectar a su capacidad de movimiento. Así, los músculos de los humanos han sufrido una adaptación que los diferencia en fisionomía y movimiento de los músculos de un ratón, de movimiento mucho más rápido. No obstante, en ambas especies el sarcómero sigue siendo la unidad de contracción y la titina, actina y miosina, las proteínas responsables del movimiento. Por tanto, ¿cuál es el origen de la gran diversidad fisiológica de los músculos y sus movimientos? Hasta la fecha no existe una explicación consensuada que proponga un razonamiento científico para la basta diversidad y evolución de los músculos. De las tres proteínas que componen el sarcómero, la titina es la que más ha cambiado su composición de aminoácidos, por lo tanto, esta puede albergar la clave de la evolución de los músculos y su diversidad locomotora. Pero, esto es solo una hipótesis que puede estar tras la gran diversidad de los animales ocurrida tras la llamada explosión Cámbrica ocurrida hace unos 542 millones de años. A pesar de que la titina haya sido objeto de estudio durante décadas, queda mucho por explorar en la correlación entre la heterogeneidad de los músculos y la bioquímica y nanomecánica de la titina.

Hoy en día es posible estudiar la estabilidad mecánica de las proteínas, gracias a complejas técnicas de espectroscopia de fuerza, dando así lugar a la aparición del concepto de nanobiomecánica. De la misma manera que los ingenieros miden la resistencia mecánica de materiales, es posible medir la resistencia
mecánica de biomoléculas utilizando técnicas espectroscópicas. Así mismo, la creciente información genética de la que disponemos en la actualidad posibilita nuevas líneas de investigación para el mejor entendimiento de los seres vivos a nivel molecular. Esto incluye el establecimiento de relaciones evolutivas a nivel genético que incluso posibilita inferir la información genética de especies extintas. Esto es lo que se conoce como Reconstrucción Ancestral de Secuencias (RAS) que ha permitido reconstruir la historia evolutiva de genes permitiendo saber cómo eran las propiedades de organismos ancestrales y las condiciones en las que vivieron [1].

En un reciente trabajo en nuestro grupo [2], el grupo de Nanobiomecánica del CIC nanoGUNE, hemos investigado la evolución de las proteínas que componen el sarcómero para determinar cómo estas han influenciado en el desarrollo evolutivo de nuestros músculos y sus movimientos. En particular, hemos profundizado en el estudio de la mecanoquímica de la titina ya que creemos que la titina podría tener un papel fundamental en la evolución molecular de los músculos de los animales. Para poder estudiar la evolución de la mecanoquímica en la titina primero hemos reconstruido titinas ancestrales y luego se han investigado sus propiedades mecánicas en el laboratorio. Valiéndonos de la técnica de reconstrucción de secuencias ancestrales podemos viajar atrás en el tiempo a nivel molecular y deducir como serían las secuencias putativas de fragmentos de titina de ancestros de especies de vertebrados actuales, incluyendo los últimos antepasados comunes de tetrápodos, saurópsidos y mamíferos. Las proteínas pueden ser obtenidas en el laboratorio y pueden ser sometidas a estudios mecánicos utilizando la técnica de espectroscopia de fuerza atómica lo cual nos permite averiguar con detalle su diseño mecánico que sin duda tendrá una influencia en el movimiento del músculo.

La técnica RAS nos permite discernir los cambios de composición que genes y proteínas han sufrido durante la evolución. Esto nos permite potencialmente obtener información genética sobre especies extintas, como por ejemplo, características fisiológicas y metabólicas o las condiciones ambientales en las que vivían estos organismos ancestrales. Con la información genética o secuencias de proteínas de especies modernas se construye un árbol filogenético (Figura 2). Para ello, se seleccionaron 33 secuencias de proteínas titina pertenecientes a especies vertebradas modernas. Las especies modernas elegidas incluyen mamíferos, saurópsidos (vertebrados amniotas al que pertenecen reptiles y las aves), anfibios y actinopterigios (una clase de peces con estructura ósea). Las diferentes secuencias de aminoácidos que se han utilizado han sido obtenidas de las bases de datos Uniprot y GenomeNet. Las secuencias son organizadas en una matriz denominada alineamiento que permite comparar cada una de las posiciones. A partir del alineamiento construimos el árbol filogenético que se infiere mediante análisis bayesiano empleando un clúster de computación de alto rendimiento. El árbol y alineamiento contienen dos elementos fundamentales que describen la evolución de la titina. El primero es el conjunto de mutaciones que la titina ha acumulado hasta derivar en las diferentes especies. El segundo elemento es la organización de esas especies por parecido genético. Con estos dos elementos, se pueden utilizar técnicas estadísticas para inferir la secuencia más probable de los ancestros de estas especies, representados por cada uno de los nodos de árbol.

Debido al gran tamaño de la titina, se selecciona una porción de la misma representada por 8 dominios situados en la banda elástica de la titina. En concreto, se trabajó sobre los dominios I65-I72. Así, se obtuvieron las secuencias de cinco especies modernas que se utilizaron para estudios comparativos, ya que las especies modernas representan el punto final, momentáneo, de la evolución genética. Los animales actuales que se estudiaron fueron el pinzón, la gallina, la orca, el ratón y humanos. Las especies ancestrales que se han estudiado en el laboratorio son el último ancestro común de los tetrápodos (LTCA, de sus siglas en inglés Last Tetrapod Common Ancestor) que vivió en el periodo Carbonífero hace 356 millones de años; de los saurópsidos (LSCA) que vivió en el periodo Pérmico hace aproximadamente 278 millones de años; de los mamíferos (LMCA) que vivió durante el periodo Jurásico hace 179 millones de años; y por último, el antepasado común de los de mamíferos placentados (LPMCA) que vivió durante el periodo Cretácico hace 105 millones de años. En el laboratorio, las proteínas se sintetizan a partir del gen siguiendo protocolos bien conocidos y establecidos en el ámbito de la biología molecular.

Uno de los aspectos interesantes de reconstruir secuencias de organismos extintos es que la simple comparación con sus descendientes modernos dice mucho sobre los organismos ancestrales. Por ejemplo, del estudio de titinas ancestrales nos dice que en los últimos 350 millones de años, la secuencia de la titina ha variado en un 25% aproximadamente. Para hacernos una idea del significado de este cambio, lo hemos comparado con el cambio sufrido por las otras proteínas musculares, actina y miosina. En el caso de la miosina el cambio ha sido de apenas 10% y para la actina solo un 1%. Esto sugiere que tanto la miosina como la actina se han conservado mucho más durante la evolución y fortalece la teoría de que la titina ha contribuido más activamente a la diversificación molecular del sarcómero. Así mismo, un dato significativo que observamos en esta comparación es que las titinas ancestrales tienen más aminoácidos cisteína que las modernas. Los aminoácidos cisteína son los encargados de establecer los conocidos puentes disulfuro en las proteínas, que son enlaces entre átomos de azufre muy resistentes desde el punto de vista de estabilidad. Esto es significativo ya que la cisteína es uno de los aminoácidos que menos probabilidad tiene de mutar una vez adquirido. Todas estas razones nos sugieren que los
residuos de cisteína juegan un rol crucial en la titina. Teniendo en cuenta la importancia de los puentes disulfuro en la mecánica de las proteínas creemos que el número de puentes disulfuro está relacionado directamente con la evolución mecanoquímica de la titina.

Desde un punto de vista experimental, para poder estudiar las propiedades mecánicas de la titina utilizamos la técnica de espectroscopia de fuerza atómica (AFM). Esta técnica, permite trabajar con moléculas individuales las cuales pueden ser sometidas a fuerzas en el rango de los piconewtons, en un proceso que se asimila a como la titina estaría sometida a fuerza de estiramiento en el mismo músculo. Para ello, las proteínas se sitúan en una superficie de oro y son adheridas a una micropalanca denominada cantiléver que actúa como un muelle. Un complejo mecanismo electrónico produce movimientos precisos de la superficie haciendo que la proteína flexione la micropalanca, la cual, debido a su naturaleza elástica, tiende a volver a su posición inicial aplicando así una fuerza mecánica. Cuando esta fuerza pasa un determinado umbral, la proteína se despliega estirándose por completo. La fuerza a la que se produce este deplegamiento es la llamada estabilidad mecánica y puede ser  cuantificada con gran precisión. La extensión de las proteínas al estirarse queda monitorizada, lo cual permite estimar sus resistencia mecánica así como la extensión de una proteína. Esta monitorización es en forma de picos en diente de sierra, donde cada pico representa el estiramiento de una proteína individual. En la (Figura 3) se puede ver el diseño experimental así como resultados experimentales de la medida de estabilidad de diferentes fragmentos de titina. A partir de estos resultados podemos saber qué proteínas son más resistentes mecánicamente lo cual se podrá relacionar con características fisiológicas del movimiento muscular.

El resultado más notable de nuestros experimentos es que la resistencia mecánica de las diferentes titinas ha seguido una tendencia evolutiva por la que las especies ancestrales demostraban una mayor estabilidad mecánica. Dicha tendencia refleja una pérdida paulatina de estabilidad mecánica en los linajes de mamíferos, especialmente (Figura 4). Pero además, se deduce que los animales de menor tamaño poseen titinas de mayor estabilidad mecánica, lo cual nos llevó a preguntarnos si la estabilidad mecánica de la titina está relacionada con el tamaño.

Con objeto de probar esta sugerencia se nos ocurrió probar una simple correlación: la estabilidad mecánica frente a la masa corporal de cada uno de los vertebrados. De esta correlación surgió una dependencia no lineal que puede ser interpretada como una correlación alométrica (Figura 5). Con frecuencia en la naturaleza se plantean relaciones no lineales que pueden ser descritas acudiendo al concepto de alometría. En biología la alometría se refiere a la variación diferencial de dos características relacionadas, por ejemplo, podemos observar alometría en el crecimiento de las partes de nuestro cuerpo. En evolución, la alometría también se puede apreciar en la variación de características entre especies. La alometría que observamos aquí es justamente evolutiva, es decir, la estabilidad mecánica de la titina ha variado de forma diferente en función del tamaño de las especies. No se trata de la única tendencia alomérica que relacionaría la masa corporal de los organismos con una característica fisiológica como por ejemplo el ritmo metabólico, velocidad, presión arterial o producción de calor. De hecho, con frecuencia se observan relaciones alométricas en sistemas biológicos, incluso para la actividad enzimática se ha sugerido una relacion alomérica. Sin embargo, esta es la primera vez que se demuestra una relación alométrica entre una característica fisiológica y un parámetro físico a nivel molecular.

Por simple extrapolación, de esa correlación se puede predecir la masa corporal de las especies extintas. En nuestro caso determinamos un rango de peso para los ancestros comunes: 8-70 g para LTCA, 14-16 g para LSCA, 14-70 g para LMCA y 95-116 g para LPMCA. Pesos típicos para animales con tamaños comprendidos entre los 10 y 40 cm de largo. Estimación que se adapta sorprendentemente bien al tamaño de los fósiles que podrían estar relacionados con estos ancestros.

Nuestros resultados indican que la evolución de la fisiología muscular está aparentemente ligada a la evolución molecular de la titina en los tetrápodos. La reconstrucción de titinas ancestrales nos ha mostrado que las propiedades mecánicas para los dominios de titina del pinzón son similares a los de sus ancestros. Sin embargo, los dominios de titina de los mamíferos de hoy en día han sufrido cambios más drásticos, resultando que las titinas modernas tengan menos estabilidad mecánicas que sus homologas ancestrales. Esta diferencia es significativa teniendo en cuenta que el número de mutaciones en la titina del pinzón y de los mamíferos modernos es similar. Esto podría estar relacionado con el hecho de que los cambios morfológicos y fisiológicos que los mamíferos han sufrido han sido más acusados derivando en una vasta diversidad física y locomotora en estos. Por ejemplo, la gran diferencia de tamaño entre el mamífero más pequeño, la musaraña etrusca, y el más grande, la ballena azul, no se observa en los grupos de aves, reptiles o peces.

Este fenómeno nos lleva a preguntarnos si la relación entre la mecánica de la titina y la contracción muscular difiere entre las especies con diferentes características fisiológicas. Una posible explicación sería que las rápidas contracciones musculares de los amniotas (una clase de vertebrados pequeños) dependen de la respuesta mecánica de la titina. Bajo fuerzas fisiológicas se ha demostrado que los dominios de la titina se despliegan y repliegan durante las contracciones musculares. Los puentes disulfuro ayudan a que la titina no se estire demasiado y aceleran la velocidad de replegamiento de uno de los dominios, lo que también puede aumentar la velocidad de contracción del músculo. Por esto, creemos que el equilibrio entre la estabilidad mecánica y los puentes disulfuro son clave en la evolución mecánica de la titina.

Los tamaños que hemos obtenido para las especies ancestrales utilizando la correlación alomérica se puede explicar a la luz de los datos en registros fósiles. Hay estudios que han demostrado que tras la extinción masiva en el periodo Devónico tardío, el llamado evento Hangenberg (hace 359 millones de años), la mayoría de especies encontradas en fósiles medían menos de 41 cm. Hecho que concuerda con el tamaño que dedujimos para LTCA, que vivió justo después del evento Hangenberg. Los fósiles de los primeros amniotas, que incluyen a los saurópsidos y a pequeños reptiles semejantes a los mamíferos de los periodos del Carbonífero y Pérmico, también se encuentran en ese rango. En el caso de los mamíferos, muchos estudios demuestran que incluso los primeros mamíferos se parecían a pequeños roedores. Lo cual es coherente con lo que predijimos a partir de la información nanomecánica de la titina. Sin embargo, no se puede establecer una comparación directa entre nuestras estimaciones y los fósiles ya que un solo fósil puede ser datado como LTCA, LSCA, LMCA o LPMCA, representando al ancestro común en varios organismos. Estudiar otras regiones de la titina o comparar otras características como la velocidad de contracción de dominios ancestrales y modernos sería interesante para llegar a entender por completo los elementos moleculares que han participado en la evolución de la titina y la conexión que pueden tener con la fisiología muscular.

Referencias

[1] Perez-Jimenez, R. et al. Single-molecule paleoenzymology probes the chemistry
of resurrected enzymes. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 592–596 (2011).

[2] Manteca, A. et al. Mechanochemical evolution of the giant muscle protein titin as
inferred from resurrected proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. (2017).